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要想实验做得好,PCR仪的操作很重要
发布时间:2019-09-05   点击次数:7次
   要想实验做得好,PCR仪的操作很重要
  PCR仪是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。利用升温使DNA变性,在聚合酶的作用下使单链复制成双链,进而达到基因复制的目的。可实现更好的引物退火温度控制,该技术的一种形式便是设计带有三个或更多分割金属模块,对于样品温度控制的能力对于PCR检测结果的准确性和整体性能十分重要。仪器特异性的参数如升降温速度,维持时间以及算法对于预测样品温度,包括模块温度都是准确控制样品温度的关键。它的升降温速度意味着在一定时间内发生的PCR步骤之间的温度变化,并通过用摄氏度每秒(°C/sec)作为单位。 相应的“升温”和“降温”分别代表着热模块的加热和冷却过程。
  PCR仪的操作注意事项:
  尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:
  1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;
  2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,PCR仪吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;
  3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;
  4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;
  5.最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;
  6.操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;
  7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,使用可替换或高压处理的加样器。
  如没有这种特殊的加样器,至少PCR仪操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;
  8.重复实验,验证结果,慎下结论。
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